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人CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

热度0票  浏览309次 时间:2012年8月29日 14:21
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【摘要】  目的: 用AdEasy腺病毒载体系统构建CTLA4Ig重组腺病毒,以感染树突状细胞使其递呈抗原至T淋巴细胞功能受阻. 方法: 双酶切、凝胶回收方法从质粒pCDM8CTLA4Ig提取目的基因CTLA4Ig,构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrackCTLA4Ig;经酶切线性化后的pAdTrackCTLA4Ig与AdEasy1进行同源重组,经酶切线性化转染入HEK293细胞进行包装. 结果:卡那霉素抗性筛选和PacⅠ酶切确证重组腺病毒质粒pAdCTLA4Ig, PacⅠ酶切产生30 kb和4.5 kb 2个片断为同源重组. 重组腺病毒质粒经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获病毒并制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为1.6×109). 结论: 成功构建了携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体,为利用CTLA4Ig基因转染树突状细胞的基因治疗奠定了基础.  学术论文网n yV`%VP&l_9R9k
【关键词】  CTLA4Ig基因;腺病毒科;遗传工程 学术论文网 Sb(X;R1v+['R%\ V
  【Abstract】 AIM: To construct recombinant adenovirus vector carrying the human cytotoxic lymphocyte antigen 4 immunoglobulin (CTLA4Ig) gene and amplify the adenovirus vector in HEK293 cells, and then to infect dendritic cells to block the submission of antigen from dendritic cells to T lymphocytes. METHODS: CTLA4Ig gene with the suitable enzyme site was doubledigested with restrictive endonucleases HindIII and XbaI from pCDM8CTLA4Ig vector, then subcloned into the shuttle plasmid pAdTrackCMV after digested by the same enzyme. The recombinant plasmid pAdTrackCTLA4Ig linearized by PmeI, was chemically transfected  into E. coli BJ5183 cells that had been chemically transfected with  adenovirus backbone plasmid pAdEasy1. Finally, the linearized recombinant plasmid was transfected into HEK293 cells. RESULTS: Recombinants were selected by kanamycin resistence and confirmed by  PacI. The restrictive endonuclease analysis confirmed that correct recombinant adenovirus plasmid was constructed(30 kb and 4.5 kb fragments were dotained after PacI digestion). Twentyfour hours after transfection, the fluorescence was observed in 293 cells, and viral tite was checked by GFP(1.6×109). CONCLUSION:  The recombinant adenoviral vector containing CTLA4Ig gene has been successfully constructed, which offers a basis for the gene therapy of CTLA4Ig infecting the dentritic cells. 学术论文网4^E$k)j z
  【Keywords】 CTLA4Ig; adenoviridae; genetic  engineering 学术论文网1x\Ab|blk$X h
  0引言
#u4shfaOYIe0  近年来食物过敏的患病率逐年上升,治疗食物过敏唯一有效的措施是严格避免特定食物抗原的摄入. 然而,引起婴儿过敏的食物往往是婴儿食物的主要来源,严格的食物回避可造成婴幼儿营养不良. 因此,预防和治疗是研究食物过敏的两个重要方向.
"D;n*@}L)nk@;I0  食物过敏的发生机制主要是食物抗原到达肠黏膜经树突状细胞递呈至T细胞导致局部T细胞活化. T细胞的活化是第一信号(TCR/MHCAg)及辅助刺激信号共同作用的结果,肠道黏膜内T细胞的异常活化导致特异性IgE产生增多[1]. 目前食物过敏治疗方法研究包括经典的治疗方法、重组蛋白突变免疫疗法、抗IgE抗体疗法以及基因疗法等,目的均为减少特异性IgE的产生,但并未阻断过敏反应产生. 如果能中断食物抗原在肠道树突状细胞的递呈,即若树突状细胞表达跨膜蛋白细胞毒性淋巴细胞抗原4免疫球蛋白(cytotoxic  lymphocyte antigen 4 immunoglobulin, CTLA4Ig),与树突状细胞表面分子B7结合,即可阻断T细胞表面分子CD28与B7结合,降低T细胞的活化,则可能阻断过敏反应产生. 本研究拟构建可转染树突状细胞的表达CTLA4Ig的腺病毒体系[2-3]. 学术论文网$af9b'h[TF
  1材料和方法 学术论文网R1P@J.fL
  1.1材料
u"HeW*|[0  质粒pCDM8CTLA4Ig(HindⅢ,  XbaⅠ)(第三军医大学烧伤外科研究所罗高兴博士惠赠),穿梭质粒pAdTrackCMV及骨架质粒pAdEasy1(芝加哥大学TC. He博士惠赠),大肠杆菌BJ5183、DH5α(重庆医科大学病毒性肝炎研究所),PCR试剂盒,DNA Ligation Kit 试剂盒、限制性内切酶HindⅢ, XbaⅠ, Trizol试剂、小量质粒提取试剂盒,DNA片断纯化试剂盒(TaKaRa公司),限制性内切酶PacⅠ, PmeⅠ(NEB公司),LipofectamineTM 2000(Invitrogen 公司),PCR引物由上海鼎安生物技术有限公司合成,CTLA4Ig引物序列为上游:5′ATGGGTGTACTGCTCACACAG3′;下游为:5′TCATTTACCCGGAGACAGG3′.
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N'b(KB^ge9^0  1.2方法[4]
5b(}z2I&f1E!c0g!q0  1.2.1双酶切法质粒pCDM8CTLA4Ig被在大肠杆菌中扩增后,以HindⅢ和XbaⅠ双酶切获与理论片断相符的CTLA4Ig片断,用凝胶回收试剂盒回收;腺病毒穿梭质粒载体pAdTrackCMV被HindⅢ和XbaⅠ双酶切后呈开环状,在16℃下与回收的CTLA4Ig片断经DNA Ligation Kit连接.     连接后产物被转化至大肠杆菌DH5α,提取的质粒pAdTrackCTLA4Ig以HindⅢ和XbaⅠ双酶切后鉴定. 学术论文网b:fY?*z
  1.2.2转化将骨架质粒pAdEasy1转化至BJ5183, 并制备BJ AdEasy1的感受态,经PmeⅠ单酶切的pAdTrackCTLA4Ig加入BJAdEasy1感受态进行转化,提取的质粒经PacI单酶切鉴定.
#V$SG{s7Q4q3gd0  1.2.3转染、包装
r\ o5?7jw0  1.2.3.1HEK293细胞的培养HEK293(人胚肾)细胞于含100 mL/L胎牛血清的1640培养基,37℃, 50 mL/L CO2 孵箱中培养. 转染时细胞应融合至70%~80%. 学术论文网9Zf,`j.[{bc
  1.2.3.2重组腺病毒转染、包装重组质粒pAdCTLA4Ig  4 μg经PacⅠ酶切线性化,经LipofectamineTM 2000介导转染25 cm2 培养瓶中的HEK293细胞,于37℃, 50 mL/L CO2孵箱中孵育,转染后1~10 d连续观察绿色荧光蛋白的表达.
$~$Ku Sq D]0  1.2.3.3重组腺病毒的提取、再次感染收集出现病变的293细胞及培养液,800 r/min,离心5 min弃上清,以1 mL PBS重悬细胞,液氮/37℃反复冻融3次,离心后吸取上清,用0.22 μm滤器过滤除菌,即可得到病毒原液. 取病毒原液200 μL再次感染293细胞提高病毒滴度. 收集方法同前.
6W ^v0T \-wID!\0  1.2.4重组腺病毒滴度测定将293细胞按1.5×105细胞/孔接种6孔板中,待24 h后感染病毒;取病毒原液作不同比例稀释(1∶103~1∶1010),每种浓度做三个复孔;按每孔400 μL加病毒稀释液至293细胞培养板中,放置37℃,吸附4~6 h;换新鲜培养基,继续培养24 h,于荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数. 按下列公式分别计算两种重组腺病毒的滴度:病毒滴度(pfu/mL)=GFP细胞阳性数×病毒上清稀释倍数(pfu/mL)/0.4 mL
0^s ]T~.?6M'Bpk[0  1.2.5PCR反应鉴定及测序连接的质粒pAdTrackCTLA4Ig, 293细胞包装成功的腺病毒AdCTLA4Ig进行PCR反应,1  g/L琼脂糖凝胶电泳,并送重庆医科大学感染病研究所测序.
0inV"ujU^0  2结果 学术论文网)E2`6a\gl]
  2.1目的基因CTLA4Ig的酶切、鉴定与回收质粒pCDM8CTLA4Ig经HindⅢ和XbaⅠ双酶切后获得目的基因CTLA4Ig,经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定,第1, 2, 3泳道均可见到目的基因片断CTLA4Ig约1200 bp(图1). 对双酶切后的目的基因片断CTLA4Ig进行凝胶回收. 学术论文网J#j8R}-SCfjN
  2.2穿梭质粒pAdTrackCTLA4Ig的构建与鉴定及基因测序HindⅢ和XbaⅠ双酶切pAdTrackCMV,纯化后与回收的目的基因CTLA4Ig连接;挑取菌落,提取质粒,再以HindⅢ和XbaⅠ双酶切,经8 g/L琼脂糖凝胶电泳,第1,8泳道出现1200 bp左右大小条带的克隆(图2),经PCR鉴定出现目的条带(图3). CTLA4Ig基因测序结果有2个碱基发生突变,尚无氨基酸的改变. 学术论文网 J;PjO gcE5^\ Q
  2.3重组腺病毒质粒pAdCTLA4Ig的构建及鉴定pAdTrackCTLA4Ig和pAdEasy1同源重组后挑选电泳条带较pAdEasy1大质粒PacⅠ酶切后于5 g/L琼脂糖凝胶电泳出现4.5 kb和30 kb左右两条条带,与理论上PacⅠ酶切后出现4.5 kb或3.0 kb和30 kb左右两条条带相符(图4). 学术论文网6P H6zZ$|o
  2.4重组腺病毒转染HEK293细胞测定将重组腺病毒pAdCTLA4Ig质粒用PacⅠ酶切线性化后转染HEK293细胞,转染24 h后,即可于倒置荧光显微镜下观察到散在少量明亮的绿色荧光表达(图5A),随时间的延长荧光量逐渐增加. 至6~7 d绿色荧光斑点最多(图5B). 待培养至10 d左右细胞呈空泡样病变并逐渐呈悬浮生长时收获病毒上清,并再次感染HEK293细胞,将重组腺病毒在HEK293细胞大量扩增后,收集病毒上清. 病毒上清中为感染性重组腺病毒,提取病毒DNA,经PCR反应扩增可出现特异的目的基因片断(图3).
!Ey%kt!s`~6f*TT0  2.5重组腺病毒滴度测定重组腺病毒经测定病毒滴度为1.6×109, 说明病毒滴度较高,可满足在体基因治疗的需要,且纯度较高.
6i } h p`&[ ka0  3讨论 学术论文网t6^)I YX W
  3.1T细胞活化抑制食物过敏主要是由T细胞介导的免疫反应. 抗原特异性T细胞的活化需要共刺激信号的参与. 目前已发现多种辅助刺激信号系统,如B7/CD28CTLA4系统、CD40/CD40L系统、CD95(Fas)FasL系统等. 但在所有辅助刺激信号途径中,B7/CD28CTLA4系统被认为是最重要的辅助刺激信号系统[5-6].
)a7|v9d1y]/} Un m0  B7与CD28的结合是引起T细胞活化的必需条件,而CTLA4是细胞毒性T淋巴细胞中特异性抗原基因编码的糖蛋白,其胞外段的主要功能是与B7结合,其功能是抑制T细胞的活化. 1992年Linesly等首先将人CTLA4胞外段第1~125氨基酸与人IgG Fc段的CH2, CH3及γ区的相应基因融合,并将其命名为CTLA4Ig. 因CTLA4为免疫球蛋白超家族成员,当其胞外段与IgG Fc段融合后,能较好的维持分子的完整性及空间构象,从而保证与B7分子结合等功能[3-4]. CTLA4与B7的结合力比CD28强20~100倍[2]. 本文研制阻断B7CD28途径的CTLA4胞外段制剂,以阻断T细胞活化中的B7CD28途径,进而阻断T细胞的完全活化,为免疫治疗食物过敏的另一途径. 学术论文网Ck@;f_ V y |$]
3.2载体的选择常用转染基因的载体有质粒和病毒两种. 质粒载体往往转染后在细胞内存活时间过短,表达不稳定,现已不为首选. 转染基因的病毒载体有逆转录病毒和重组腺病毒. 因重组腺病毒载体在体内外均有较高的转染效率,可同时感染静止期和分裂期细胞,腺病毒通过与细胞表面受体结合将其基因组有效导入宿主细胞,腺病毒基因组不整合到宿主细胞基因组中,而使宿主的遗传特性不发生改变. 因此利用腺病毒载体进行目的基因转运,被用于多种疾病的基因治疗具有显著的优势[7-8].
(rH A P/o:g.X U0  学术论文网W-Izt,BN1riG
  1995年Kay MA等采用细胞内同源重组的方法将人CTLA4Ig构建到腺病毒载体上[9]. 因通常细胞内同源重组的重组及扩增效率均较低,鉴定重组腺病毒载体需同时用PCR及ELISA两种方法,费时、操作较为繁琐. 1998年He等建立的重组腺病毒载体AdEasy系统,将穿梭质粒pAdTrackCMV与骨架质粒AdEasy1在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,然后用293细胞包装产生完整的重组腺病毒. 这种细菌内同源重组较以往的细胞内同源重组法重组及扩增效率高,且更为方便、快速. AdEasy系统还可表达绿色荧光蛋白,可作为转染成功的一个直接标志,方便了对转染细胞的筛选[4]. 本实验采用这种新型的重组腺病毒载体AdEasy系统,将目的基因CTLA4Ig构建到重组腺病毒载体上. CTLA4Ig基因测序结果显示仅2个碱基发生突变,未产生氨基酸的改变,即无义突变,不影响蛋白的表达及其功能.
7bg#gBl4ix.K0  3.3重组腺病毒鉴定重组腺病毒载体AdEasy系统构建的三个关键步骤均需鉴定,通常在前两步采用酶切法与PCR法鉴定,通常采用绿色荧光蛋白标记和PCR扩增出目的基因相结合的方法从蛋白水平和基因水平鉴定293细胞包装.  学术论文网K^Wpk h
   学术论文网;IENG+ns\M
  本实验成功地将CTLA4Ig基因构建到腺病毒载体上,拟通过腺病毒载体将CTLA4Ig基因转染到树突状细胞,使树突状细胞表达CTLA4Ig蛋白从而阻断B7与CD28的结合,为后期阻断T细胞活化治疗食物过敏的研究奠定了基础.
)`%w@7z Ot0基金项目:国家自然科学基金(30400408)
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