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人宫颈癌基因蛋白B细胞表位及其HLA限制性细胞毒性T细胞表位预测分析

热度0票  浏览282次 时间:2012年8月29日 14:16

;g^S7EU?;E0【摘要】  目的: 预测人宫颈癌基因(human cervical cancer oncogene, HCCR)蛋白的二级结构, B细胞表位及其HLAA,B限制性细胞毒性T细胞表位. 方法: 综合分析二级结构、亲水性、柔韧性、表面可及性与抗原性指数,预测HCCR蛋白的B细胞抗原表位;利用BIMAS,SYFPEITHI和NetCTL方法预测分析其HLAA*0201限制性CTL表位,运用NetCTL方法对HLAA的其他等位基因和HLAB限制性CTL表位进行预测分析. 结果: HCCR蛋白的二级结构主要由α螺旋结构组成,B细胞优势表位位于N端第41~53,216~228,310~325和355~360区段; 预测得到5个HLAA*0201限制性CTL优势表位分别为YLVFLLMYL(152~160),YLFPRQLLI(159~167),LLLHNVVLL(343~351), CLFLGIISI(138~146)和SIPPFANYL(145~153),HCCR蛋白HLAA,B限制CTL表位主要位于胞外区. 结论: 应用多参数预测HCCR蛋白B细胞表位及其HLAA,B限制性细胞毒性T细胞表位,为进一步实验鉴定其表位进而制备单克隆抗体和基于HCCR抗原的肿瘤免疫学治疗奠定了基础.

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N,D*^Q1srPrAc0【关键词】  宫颈肿瘤;癌基因蛋白质类;表位,B淋巴细胞;CTL表位

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  【Abstract】 AIM: To predict the secondary structure, the B cell epitopes and the HLAA, B restricted T cell epitopes of human cervical cancer oncogene (HCCR) protein. METHODS: The secondary structure was predicted by the methods of Proteus and SOPMA. The hydrophilicity, surface probability, flexibility and antigenic index were predicted by the methods of KyteDoolittle, Emini, KarplusSchultz and Jamesonwolf, respectively. According to the above methods, the B cell epitopes for HCCR protein were predicted. HLAA*0201restricted T cell epitopes were predicted by BIMAS, SYFPEITHI and NetCTL. And the restricted T cell epitopes of HLAB and the other alleles of HLAA were predicted by NetCTL. RESULTS: The secondary structure of HCCR1 protein was mainly composed of α helix. The B cell epitopes were probably located at or adjacent to the Nterminal No.41-53,216-228,310-325 and 355-360 regions. And the five predominant HLAA*0201restricted T cell epitopes were YLVFLLMYL(152-160),YLFPRQLLI(159-167), LLLHNVVLL(343-351), CLFLGIISI(138-146) and SIPPFANYL(145-153). The HLAA,B restricted T cell epitopes of HCCR protein were probably located at extracelluar domain of protein. CONCLUSION:  Prediction of the epitopes of HCCR protein can provide a basis for production of the monoclonal antibody and development of some promising antigen peptides for tumor vaccines.学术论文网/[ Cx"hT!l`S,yNa

4ez/v VIL0  【Keywords】 cervix neoplasms; oncogene proteins;  epitopes, BLymphocyte; CTL epitopes

3]z Q!E,W&~%I0 学术论文网f(_{4kk"K,b:s]E` z

  0引言学术论文网6t#|'P zH\7H&B
 
^@vfP0 人宫颈癌基因(human cervical cancer oncogene, HCCR)是近年来发现的与多种肿瘤相关的基因,HCCR可能作为抑癌基因p53的负调控因子,引起肿瘤的发生[1]. 其编码的蛋白可以作为一种重要的肿瘤标志物,在监测和诊断肝细胞癌、乳腺癌、结肠直肠癌等肿瘤方面具有重要的意义,是一种极为灵敏的指标[2-4]. HCCR蛋白在肿瘤治疗中可以作为一个重要的靶位点[5]. 但到目前为止, 人们对其蛋白特性及其表位生物学了解甚少. 我们根据人HCCR蛋白质的氨基酸序列,采用免疫信息学,在方法学比较的基础上,联合运用多种方法对HCCR蛋白的二级结构、B细胞表位及其HLAA,B限制性细胞毒性T细胞表位进行预测分析. 旨在为进一步鉴定其表位,研制单克隆抗体和基于HCCR抗原的肿瘤免疫学治疗奠定基础.学术论文网^3I:w]"w*WRU x

E R^-J^O!P*@H+J0  1材料和方法学术论文网3v O$l-S7Bk/x

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  1.1材料

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lsBjL(a(R0  HCCR蛋白的氨基酸全长序列从NCBI网站上获取(GenBank accession no. AAK34885),含有360个氨基酸,相对分子质量为41 803.学术论文网DZ0Y2s{:F'U$I

~]A{:n`-[0  1.2方法学术论文网vh%q3D%G!iq

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  1.2.1HCCR蛋白二级结构预测采用Proteus[6],SOPMA[7]蛋白质结构预测服务器分别预测HCCR蛋白的二级结构.学术论文网Rl)yf:S,Or5A

qAW?9jnb0  1.2.2HCCR蛋白B细胞抗原表位的多参数预测按KyteDoolittle方案预测氨基酸亲水性; Emini方案预测蛋白质的表面可及性; KarplusSchultz方案预测蛋白质的柔韧性;JamesonWolf方案预测蛋白质的抗原指数.学术论文网'T ^w%st'B$ed'f%\

y4]9z xdl0  1.2.3B细胞表位的综合分析综合比较分析上述方法,辅以对HCCR蛋白的二级结构的分析,排除二级结构位于α螺旋和β折叠内不易形成表位的序列,预测HCCR蛋白的B细胞表位.

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  1.2.4HCCR抗原HLAA*0201限制性细胞毒性T细胞表位的预测运用BIMAS,SYFPEITHI和NetCTL[8]预测服务器,分别对HCCR蛋白HLAA*0201限制性细胞毒性T细胞表位进行预测,然后按文献[9]的方法,同时结合NetCTL预测结果,综合分析HCCR蛋白HLAA*0201限制性细胞毒性T 细胞表位.学术论文网0Knyv@Q-R-q*o

V3R[G g0  1.2.5HCCR抗原HLAA的其他等位基因和HLAB限制性CTL表位的预测运用NetCTL在线预测服务器对HCCR抗原HLAA的其他等位基因和HLAB限制性CTL表位进行预测和分析.学术论文网Mr bk.u8g*uz$t

w4jF^AD[^z4`0  2结果学术论文网$F'E$l:C U

J5qJnm]6z/S.M0  2.1HCCR蛋白的二级结构Proteus分析结果显示其二级结构以α螺旋为主,占73 %,且多集中在中间区域,C末端次之. 无规卷曲占27%,主要分布在N端的第14~21,30~50,115~121,162~172,221~228,239~250,263~270,311~318和355~360区域;未预测到有β折叠结构. 而SOPMA方法预测结果为HCCR蛋白N端第13~52,66~85,111~124,139~148,160~175,221~229,263~272,310~319,349~360区段主要由构成蛋白质柔性区域的无规卷曲结构、β转角结构和伸展结构所组成,其他区域主要由α螺旋结构组成,两种方法所预测的结果基本一致. 综合以上两种方法的预测结果,认为HCCR蛋白以α螺旋结构出现的区域最多,其柔性区域即功能区主要位于N端第14~21,30~50,111~123,162~172,221~228,263~272,310~319和349~360区段(图1). C:无规卷曲区域;e:β折叠区域;h:α螺旋区域;t:转角区域.

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  2.2多参数预测HCCR蛋白表位HCCR蛋白亲水性、表面可及性、柔韧性和抗原性指数单参数预测结果如图2~5,其中高于阈值的肽段即为预测的抗原表位. 将各种参数预测的可能性表位见表1.

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  2.3HCCR蛋白B细胞抗原表位的综合预测通过联合预测亲水性、表面可及性、柔韧性和抗原性指数的方法分析HCCR蛋白潜在的抗原决定簇,结果显示在N端第41~53,63~83,99~112,121~139,172~193,221~228,274~280,310~325和355~360区段内或者附近存在着抗原表位,根据蛋白质的二级结构分析结果显示,在第101~109,130~136, 172~193 和275~280区段主要是作为骨架起稳定作用的a螺旋结构所组成,形成表位的可能性比较小. 综合比较分析,N端第41~53,216~228,310~325和355~360区段满足亲水性、可及性、柔韧性和抗原性,在二级结构上主要是由无规卷曲结构组成,最可能为HCCR蛋白的优势B细胞表位. 表1HCCR蛋白优势B细胞表位的综合比较(略)

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  2.4HCCR抗原HLAA*0201限制性细胞毒性T细胞表位的预测将BIMAS和SYFPEITHI的综合预测结果结合NetCTL(阈值设为0.80)预测结果进行综合分析,获取评分显著高与其他的5条HCCR抗原HLAA*0201限制性细胞毒性T 细胞候选表位(表2),分别为YLVFLLMYL(152~160),YLFPRQLLI(159~167),LLLHNVVLL(343~351),CLFLGIISI(138~146)和SIPPFANYL(145~153). 表2BIMAS结合SYFPEITHI和NetCTL分别预测HLAA*0201限制性CTL表位(略)学术论文网'~ ` S&p c+f1l'H

.M:D9V*zp_N'c|c0  2.5  HCCR抗原HLAA的其他等位基因和HLAB限制性CTL表位的预测  利用远程预测,登陆NetCTL,对A1,A3,A24,A26,B7,B8,B2,B39,B44,B58和B62限制性CTL表位的预测,选取综合评分前5名的序列作为优势候选表位(表3),分析发现HCCR蛋白HLAA,B限制CTL表位主要位于蛋白的胞外区. 表3NetCTL预测HCCR蛋白HLAA,B限制性CTL表位(略)

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/x ^/uf]k5N6WUf0  3讨论

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3Z Vy wm r F:zN0  HCCR是近年发现的与人类多种肿瘤相关的基因,在宫颈癌、肝细胞癌、乳腺癌、白血病等肿瘤中呈过量表达[1]. HCCR蛋白在肿瘤免疫治疗中可以作为一个重要的靶位点[5],预测其抗原表位,可为制备HCCR特异性单克隆抗体、HCCR诊断试剂的开发和针对HCCR抗原的肿瘤免疫预防和免疫学治疗奠定基础.学术论文网JdC1t,KK@ O"b
 根据KyteDoolittle预测氨基酸亲水性方案、Emini预测蛋白质的表面可及性方案、JamesonWolf预测蛋白质的抗原指数方案分别对HCCR蛋白可能的B细胞表位进行了预测,综合各单参数预测的结果,发现N端第41~53,63~83,99~112,121~139,172~193,221~228,274~280,310~325和355~360区段具有较好的亲水性、可及性、柔韧性和抗原性指数. 蛋白质的二级结构也是预测抗原表位的重要信息,α螺旋、β折叠等二级结构的化学键键能比较高,不易形成抗原表位序列,而蛋白质二级结构中β转角及无规卷曲结构,往往突出在蛋白的表面,从而构成蛋白质的功能区,因此该区域内常含有B细胞的优势抗原表位. 因此得到单参数的预测结果后,还要结合二级结构的预测结果来排除不易形成表位的序列. 综合亲水性、可及性、柔韧性和抗原指数和二级结构预测的结果,最终确定了HCCR蛋白的潜在B细胞优势表位.

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n#Vg9A5Z EJ Gc@9G0     HCCR蛋白在多种肿瘤中过度表达,可以作为免疫治疗的一个重要靶点,研究HCCR蛋白序列的CTL表位可为肿瘤免疫治疗开辟新的途径. 寻找和鉴定CTL识别的肿瘤特异性抗原肽是肿瘤免疫治疗的关键,而利用免疫信息学进行抗原表位的预测是重要的手段之一. BIMAS 和SYFPEITHI是最常用的两大CTL表位预测程序. 由于数据库和算法的差异,将导致预测结构存在差异. 将两种预测程序结合起来,可以提高表位预测的准确率[9]. 由于BIMAS 和SYFPEITHI都是基于抗原肽与MHCⅠ类结合特性而建立起来的方法,未考虑针对抗原加工处理过程的预测. 而蛋白酶体的裂解和TAP转运对CTL表位的形成至关重要.

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2e|3M~9a6xC|Hu J0  NetCTL是近年来Larsen MV等建立起来CTL表位的整合预测方法,包括对抗原肽与MHCⅠ类分子结合特性、TAP转运效率、蛋白酶体裂解基序的综合预测,其综合性能要比目前公认的两大预测程序BIMAS,SYFPEITHI要高[8]. 我们将BIMAS,SYFPEITHI和NetCT预测的结果进行综合分析,结果发现联合BIMAS和SYFPEITHI所得到的高评分序列,同样在NetCTL预测中具有很高的评分. 综合分析以上分析,获取5条HCCR抗原HLAA*0201限制性细胞毒性T细胞优势候选表位. 同时,通过NetCTL对HLAA的其他等位基因和HLAB限制性CTL表位进行了预测和分析,可为构建HLA不同等位基因限制的、基于混合T细胞表位的肿瘤治疗性疫苗提供理论依据.学术论文网wv:mq7|

fig4l/\"?a&h[ ry)O0    本研究通过生物信息学方法对HCCR蛋白二级结构,B细胞表位及其HLAA,B限制性细胞毒性T细胞表位进行了预测分析,为进一步研究该蛋白单克隆抗体的制备奠定了理论基础,也为以HCCR蛋白作为靶分子的肿瘤免疫治疗提供了新的途径,其预测的结果有待进一步的实验加以验证.学术论文网5`KR'Qng/O!XE

-`"f QM7u e0N{0基金项目:国家自然科学基金(30571646);国家重大基础研究项目(973)(2005CB522901)

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TAG: 蛋白 宫颈癌