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双功能自由基清除剂原儿茶醛缩氨基硫脲铜(II)配合物对O2.-和.OH自由基的清除作用

热度0票  浏览241次 时间:2012年8月29日 13:59

#l1RO/G6?j ]0【摘要】  目的: 研究原儿茶醛缩氨基硫脲铜(II)配合物(PTC)对高脂血症模型大鼠血脂、主动脉组织形态学及肝组织抗氧化活性的影响. 方法: 60只SD大鼠随机分为6组(每组10只),即正常对照组、高脂血症模型组、药物对照组(即费非诺贝特组,0.04 g/kg), PTC小剂量组(0.005 g/kg), PTC中剂量组(0.05 g/kg), PTC大剂量组(0.25 g/kg). 在以高脂饲料喂养5 wk开始,正常对照组和高脂血症模型组给以5 g/L羧甲基纤维素钠水溶液10 mL/kg体质量灌胃. 其他实验组分别给以5 g/L羧甲基纤维素钠水溶液配成药物混悬液灌胃,每日一次. 实验到10 wk后全自动生化分析仪测定各组动物血脂,HE染色做病理切片观察大鼠主动脉形态学变化,同时测定肝组织超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT)活性及抑制羟自由基(.OH)的能力. 结果: 原儿茶醛缩氨基硫脲铜(II)配合物能使模型大鼠肝组织清除羟自由基(.OH)的能力提高(P<0.01), SOD的活性增强(P<0.01或0.05);各剂量组均有降低血清胆固醇和提高血清高密度脂蛋白(HDLC)含量的趋势,但无统计学意义. 结论: 原儿茶醛缩氨基硫脲铜(II)配合物在实验动物体内的确有清除超氧阴离子自由基(O2.-)和羟自由基(.OH)的双功能作用. 学术论文网pZ n4`6Gg!n

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【关键词】  原儿茶醛缩氨基硫脲铜(II)配合物;自由基清除剂;超氧化物类;羟自由基学术论文网6j+W;f6V!`qd+]

)Ss1[Z8O0  【Abstract】 AIM: To investigate the effects of protocatechualdehyde thiosemicarbazonecopper(II)complex (PTC) on the serum lipids, the aortic tectology and the activity of antioxidation in liver tissues of the hyperlipemia model rats. METHODS: Sixty healthy SD rats were randomly divided into 6 groups(10 rats per group), including control group, hyperlipidemia model group, Fenofibrate drug group(0.04 g/kg) and 3  PTC groups, namely small dosage of PTC (0.005 g/kg) group, moderate dosage of PTC (0.05 g/kg)group, large dosage of PTC (0.25 g/kg)group. Control group was fed by ordinary forage;the other groups were fed by highlipid forage. From the 5th week, besides the above feeding, control group and model group were administrated intragastrically  5 g/L Carboxy Methyl Cellulose(CMC); Fenofibrate drug group and 3 PTC groups were respectively administrated intragastrically  suspension with Fenofibrate and CMC, and suspension with PTC and CMC. After 10week feeding, the levels of serum lipids were determined; aortic histomorphological changes were observed by the pathological section with the HE staining; the activities of superoxide dismutase(SOD) and catalase(CAT), and the restraining ability to hydroxyl free radical(.OH) in the liver tissues were measured. RESULTS: PTC could restrain .OH  (P<0.01) and enhance the activities of SOD (P<0.01 or P<0.05). Every PTC group had tendencies to decrease cholesterol and to increase highdensity lipoprotein cholesterol, but there had no significance in statistics(P>0.05). CONCLUSION: PTC can certainly eliminate the superoxide free radical(O2.-)and .OH in experimental animals in vivo.

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  【Keywords】  protocatechualdehydethiosemicarbazone copper(II)complex(PTC); free radical scavengers; superoxides; hydroxyl  radical

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.cpi5YE9D0    0引言学术论文网T,JW'uQ

u2W4Z/JLZXL,z)Mf0  研究表明,许多疾病的发生和发展均涉及自由基的损伤作用. 自由基的过度生成会导致人体氧化损伤,使人出现疾病和衰老加速. 人在年轻的时侯,过氧化物、自由基和抗氧化剂、自由基清除剂处于一种相对平衡状态,在受外界不良因素的影响或随着年龄增长,体内自由基的生成增加,抗氧化酶、自由基清除剂活性降低或生成减少,使这种平衡紊乱,就会出现疾病、衰老等不健康状态. 由于自由基的多态性和反应的多种形式,单一自由基清除剂或抗氧化剂虽在实验室取得明显效果,但转化为有效产品服务人类,一直是个难题. 天然酶如SOD虽然具有特异的清除超氧阴离子自由基(O2.-)的作用,在国外已进行了临床应用,但由于其价格昂贵,且在稳定性、膜穿透性、生物利用度和免疫原性等方面的原因而受到限制;另外,SOD在歧化O2.-的过程中,有可能通过HaberWeiss反应产生毒性更强的.OH而对机体产生更大的危害. 因此,寻找高效、低毒、多功能自由基清除剂就成为当前人们很感兴趣的研究课题,尤其以席夫碱为配体的金属SOD模型配合物的合成、表征及构效关系的研究倍受关注[1].学术论文网L M `8Vu Ww@6bz.jK
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  我们的实验以丹参的有效成分原儿茶醛和氨基硫脲为主要原料,合成了原儿茶醛缩氨基硫脲铜(II)配合物,并初步研究了其体外对氧自由基的清除作用和体内生物学效用[2-3],本实验用高脂血症大鼠动物模型,观察了原儿茶醛缩氨基硫脲铜(II)配合物对超氧阴离子自由基(O2.-)和羟自由基(.OH)的清除作用.学术论文网-];JP-Rj^FJw

2H`Oa G CO{k0  1材料和方法

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g C4bENX G!U#~uP0  1.1材料

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  1.1.1动物 健康SD大鼠,清洁级,体质量180~200 g,由第四军医大学实验动物中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(军)2002006.学术论文网Q.NBv!`

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  1.1.2药品原儿茶醛缩氨基硫脲铜(II)配合物(PTC),由本室合成;非诺贝特,法国利博福尼制药公司生产(批号:84564).

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  1.1.3主要试剂超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒、羟自由基(.OH)测定试剂盒购自南京建成生物工程有限公司.学术论文网 n @v+{.YT5_

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  1.1.4仪器日立 7 080型全自动生化分析仪; 721分光光度计,上海第三分析仪器厂;DG3035酶联测定仪,华东电子管厂;均质机,上海弗鲁克机电设备有限公司;TDL5低速离心机,上海安亭科学仪器厂.

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  1.2方法学术论文网:y-v4c1r/g9OEQ:]}#V

jiq O%z [0  1.2.1动物模型的建立及分组采用高脂饲料喂养SD大鼠复制高脂血症模型. 选用SD大鼠60只,雌雄各半,适应性饲养1 wk后,按性别随机分为 6组:即正常对照组,模型组,非诺贝特组(0.04 g/kg体质量),PTC小剂量组(0.005 g/kg体质量),PTC中剂量组(0.05 g/kg体质量),PTC大剂量组(0.25 g/kg体质量),每组10只. 正常对照组组喂普通饲料,其他4组均喂高脂饲料(高脂饲料配方:20 g/kg胆固醇、3 g/kg去氧胆酸钠、75 g/kg猪油、50 g/kg蛋黄粉、852 g/kg基础饲料混均匀压成块料),均自由摄食、饮水.

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  1.2.2给药自实验第5周开始,正常对照组、模型组以5 g/L羧甲基纤维素钠水溶液10 mL/kg体质量灌胃,其他组皆用5 g/L羧甲基纤维素钠水溶液配成药物混悬液灌胃,每日一次. 实验周期共10 wk.

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O cp l4L$u#e0  1.2.3样品制备及检测学术论文网1G Xy$~:U Sq7}

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  1.2.3.1取血及血脂测定实验10 wk后,禁食不禁水12 h,断头取血,3500 r/min离心10 min取血清.  胆固醇 (CHOL) 及三酰甘油 (TG) 采用终点法、高密度脂蛋白 ( HDLC) 采用一步法测定. 试剂盒由北京利德曼生化技术有限公司生产.

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Tu~0?-r a0  1.2.3.2取组织及做SOD, CAT及清除.OH活性测定大鼠断头处死后,立即取肝脏,用生理盐水清洗,立即置低温冰箱(-40℃)备用. 在测定之前,在冰浴中用生理盐水制成不同浓度的组织均浆,按试剂盒说明做SOD, CAT及清除.OH活性测定,同时用考马斯亮蓝法[4]测定组织均浆中的蛋白含量.学术论文网:c&U:Q&Uf,[x/|

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  1.2.3.3病理形态学观察断头处死动物,快速在主动脉弓与胸主动脉交界处取约1 cm血管,用生理盐水轻轻冲洗后,置40 g/L多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋,制备石蜡切片,HE染色,光镜观察病理改变.

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  1.2.3.4数据处理数据用x±s表示,采用 SPSS10.0软件包进行统计处理,组间比较用方差分析,两两比较用SNK.

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  2结果

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  2.1PTC对大鼠血脂含量的影响高脂血症模型组大鼠血清CHOL, HDLC 较正常对照组升高,有显著性差异(P<0.05),TG无显著差异;非诺贝特组与模型组比较,血清CHOL降低, HDLC升高,有显著性差异(P<0.05);其他组无显著性差异;另外,由于实验动物性别差异较大,测定的标准差相对较大. 其结果见按表1.表1PTC对大鼠血脂含量的影响(略) 学术论文网,j4n:h]g(y
2.2主动脉壁组织形态学变化实验大鼠主动脉HE染色光镜病理切片显示,正常对照组动脉内膜光滑,内皮细胞完整,内膜下间隙较小,平滑肌细胞排列整齐,胞浆染色红染;模型组内皮细胞广泛损伤脱落,脂质沉积,见平滑肌细胞胞浆空泡状,胞浆疏松淡染,平滑肌细胞排列紊乱,可见有巨噬细胞;药物对照非诺贝特组内膜光滑完整,平滑肌细胞排列较整齐,有增生,胞核密度增加,一些平滑肌细胞有空泡状改变;PTC各剂量组血管平滑肌均排列整齐,内皮完整,平滑肌细胞脂质沉积模型组比较明显减轻,可见巨噬细胞. 见图1.学术论文网7`,FQ3W Y4a

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  2.3PTC对实验大鼠SOD, CAT活性的影响实验大鼠肝组织SOD活性,模型组与正常对照组比较,有下降趋势,但无统计学意义;PTC各剂量组与模型组、正常对照组比较均增高,有差异(P<0.05),PTC小剂量组增高更加明显(P< 0.01). 而大鼠肝组织CAT活性,模型组与正常对照组比较,有下降趋势,PTC各剂量组与模型组、对照组比较都有增高趋势,但无统计学意义. 见表2.学术论文网6i[)O rf*m#V,u

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  2.4PTC对大鼠肝组织抑制.OH 的活性作用实验大鼠肝组织抑制.OH的活性测定结果,模型组与正常对照组比较,其抑制.OH的活性降低(P<0.01),而PTC各剂量组及非诺贝特组与模型组比较,其抑制.OH的能力均增强 (P<0.01),且PTC组有随剂量的增大而增强的趋势(表2). 表2PTC的清除自由基作用(U/mg, x±s)学术论文网_k w;Io[v

)A/YEc#c0U_+O`7{0  3讨论

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  心脑血管疾病是导致人类死亡的首位原因,而动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是众多心脑血管病的主要病理基础. 多年来,对于动脉粥样硬化的发病机制和预防治疗,医学科学工作者进行了不懈的探讨,己取得了很大成就. 但是,由于动脉粥样硬化是一个十分复杂的病理过程,其详细的发病机制至今尚未完全明确. 代谢综合症(MetS)是早期动脉粥样硬化患者发生血管疾病的高风险状态. MetS患者体内的脂蛋白中低密度脂蛋白(LDL)增高,这对氧化条件更加敏感. 脂蛋白氧化在体外通过酶的或非酶的抗氧化剂可以被抑制,但高密度脂蛋白(HDL)在保护LDL不被氧化过程中也发挥了关键性的作用[5]高脂血症与AS有密切的关系,尤其是胆固醇与三酰甘油皆增高的,患AS的危险性更大. 目前关于AS起因的一个流行的理论认为,AS开始于血管内皮细胞的损伤,引起一些血循环中的单核细胞浸润到内膜下,并在血管壁上成为巨噬细胞,活化了的单核细胞和巨噬细胞分泌O2.-, H2O2和水解酶损伤邻近细胞. 巨噬细胞释放因子可以刺激平滑肌细胞增生. 巨噬细胞释放血小板刺激因子使血小板黏附到损伤的内皮细胞上,进一步引起释放其他使平滑肌细胞增生的因子[6]. 在生物体内自由基的产生与消除是一个动态平衡的过程,自由基充当了普通反应介质的作用,它受到生物反应网络中其他生物活性分子的作用和调控[7],自由基的产生与消除失衡,可能导致疾病的发生,如动脉粥样硬化.学术论文网8U&z:XpG K

hB;@n(x {0  关于高脂蛋白血症,按照高脂血症的定义,无论是胆固醇含量增高,还是三酰甘油的含量增高,或是两者皆增高,统称为高脂血症(hyperlipemia). 对于高脂蛋白血症模型,本实验采用高脂饲料喂养的方法,到实验的第10 wk结束测定,模型组血清胆固醇、高密度脂蛋白含量均增高,较正常对照组比较,相差显著(P<0.05),三酰甘油变化不大,且实验动物的性别间差异较大. 从实验大鼠主动脉组织形态学变化看,高血脂症模型组内皮细胞广泛损伤脱落,脂质沉积,见平滑肌细胞胞浆空泡状,胞浆疏松淡染,平滑肌细胞排列紊乱,内膜可见巨噬细胞,说明模型复制成功.

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!OAp@ ["G/g0  我们的实验设计是基于,原儿茶醛缩氨基硫脲铜(II)配合物从其分子结构上看,酚羟基和铜离子,具有清除O2.-的作用,而硫脲具有清除.OH的作用,设想二者在体内具清除O2.-和.OH的双功能作用.
;~O6fE!IK:T7{0  我们的实验结果表明,PTC确能显著提高模型大鼠肝组织抑制.OH的能力,增强SOD活性,且其作用随剂量的增大而增强;而对CAT的活性作用影响较小,只有升高趋势,但无统计学意义;从组织形态学变化看,PTC各剂量组血管平滑肌均排列整齐,内皮完整,平滑肌细胞脂质沉积与模型组比较明显减轻,这说明原儿茶醛缩氨基硫脲铜(II)配合物在体内确有清除O2.-和.OH自由基的能力;给与适当剂量的原儿茶醛缩氨基硫脲铜(II)配合物可以减轻高脂血症大鼠血管内皮细胞的病理性损伤.
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基金项目:陕西省卫生厅科研基金项目(04D15)学术论文网M%V~[o&T$z

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【参考文献】
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TAG: 自由基 氨基 硫脲